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桉树是世界著名的速生丰产用材树种。我国引种桉树已经有120年的历史,是广西、广东、海南等华南各省的最主要造林树种,可在平原、台地、丘陵、低山等地貌的林地种植,是近年来发展速度较快的树种。并且,桉树具有较高的经济价值和广泛的用途,它是造纸原料的重要来源,它的木材还可以加工成家具,不但质量好,而且十分美观。而桉树组培的成功,主要解决了一些难以生根的树种或无法采用扦插方法增繁无性系的繁殖问题,加快优良无性系的繁殖速度,桉树组培苗的生产前景非常广阔。

桉树组织培养是一项技术性很强的工作,无菌条件要求严格,对实验室设备及人员的操作技术要求较高,组培实验室应配备下列设备。第一、洗涤设备:设置洗涤室、洗涤剂及各种洗涤工具。第二、灭菌设备:设置高压高温灭菌锅。第三、化学实验设备:设置实验台架、药品柜、冰箱、天平、各种、玻璃器皿、PH计、搅拌器等。第四、无菌操作设备:设置接种室、超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀及酒精灯等。第五、培养设备:设置培养室、培养容器、三角瓶、罐头瓶等。

植物组织培养应用的培养基,一般都包括大量元素、微量元素和碳水化合物,并添加各种各样的附加物,如维生素、氨基酸、生长素、细胞素等。桉树芽的诱导可选用N6和MS等作基本培养基、胚状体的诱导可选用B5H及改良H等作基本培养基。

目前,桉树无性系组织多采用外植体直接诱导腋生丛生芽,然后切取足够长度,长得健壮的小芽转到生根诱导培养基中,形成生根植株。采用这种方法,桉树的遗传性最稳定。

采集对象为桉树嫁接苗或伐桩、环割、萌芽条。截取具有半木质化程度的嫩梢,长度为5~10cm。试验证明,3~5月份桉树萌芽率较高,茎部积累有较丰富的营养物质和内源激素,受病虫侵害较少、外植体诱导成功率最高。7~9月份属高温高湿季节,水分、温度都较高,病虫十分活跃,茎段机械损伤较多,易受病、虫菌的侵害污染,故诱导成功率最低。因此外植体采集最好是在春季进行,以芽条腋芽开始膨大,芽鳞片还未裂开时为最佳时机。芽条在植株上的部位也是诱导芽能否成功的重要因素。试验证明,萌芽条中上部的茎段,以半木质化的茎段第5~第7节最好,因为较易进行表面灭菌处理,而且不容易褐化,萌芽率也高;过嫩的芽木质化程度低,表面灭菌很容易被杀死;过老的茎段表面灭菌时容易褐化而死亡,而且过老的茎段再生能力差而不易萌芽。

将采回的桉树嫩茎段剪去叶片,用少量洗衣粉水漂洗10分钟,再用流动水冲洗半小时左右,然后在无菌条件下用75%酒精浸泡5秒钟,再用新洁尔灭溶液或0.1﹪升汞溶液浸5~6分钟消毒,用无菌水冲洗4~5次,然后切取含1~2个腋芽的茎段接种在培养基上进行诱导培养,试验证明,重复消毒一次效果更佳。

桉树茎段接种后,如切口处产生褐色渗出物,使茎段周围的培养基变成棕褐色,这种现象就叫“褐变”。茎段在培养基内变褐色就会失去生命力,导致外植体死亡、严重地影响了外植体诱导的成功率,可采取以下措施综合防治。

④利用漫射光培养。由于光能提高多氧化酶的活性,从而促进多酚化合物的氧化,因此在弱光下培养,能有效地降低多酚氧化物的氧化。

⑤及时转移培养基,当发生褐变时应及时转移培养基,使褐化不影响腋芽周围的组织,外植体仍有萌动的生命力。

将诱导出的芽体转接到继代苗培养基里,然后放置于培养室内,室温为25℃——28℃为宜,光照强度为1500——3000LX为佳。过强的光照易使苗木老化,过弱的光照易使苗木徒长,所以控制好光照很重要。经过了七天左右的暗培养,即可见萌生出多丛嫩芽,经过1——2天的自然光照后,即可开日光灯增强光照。若发现霉菌及真菌感染的苗,要及时拿去高温消毒,以免传染了其他的瓶苗。

玻璃苗:是指由于苗木不能及时见光,苗木木质化低。表现为叶片及嫩梢呈现出透明或半透明状态,含水量增加,叶片脆弱易碎,这种状态的苗木很难增殖及生根,移栽时不易成活。解决办法:及时见光。苗木进行暗培养七天以后,立即见自然光1——2天,然后即可打开日光灯进行补光。日光灯照一周后即可将瓶苗移到窗口进行炼苗,使其吸收更加强烈的自然光照,以加快苗木的木质化程度。

褐化:是由于培养基中的酚类物质被氧化,使苗木周围的培养基呈现褐色。褐化会使苗生长缓慢,也容易变成苗,这样会影响后面的生根增殖。解决办法:及时转换培养基。

继代苗经过了多次继代增殖后,会长出许多丛芽,主芽多且明显,而且芽丛炼至半木质化时即可进行大量生根接种,以获取完整生根植株。进行生根接种时,应当选取干净、不带菌的继代瓶苗,在超净工作台中,用消毒好的剪刀剪取顶芽粗壮,叶片展开良好的半木质的一段继代苗,长度约为1.5厘米,插入生根培养基中。每瓶视情况插入15——20棵苗。生根苗接好后将其置于培养室中,室温控制在25℃——28℃,与继代苗的管理方法相同,也是进行七天左右的暗培养,待生根苗基部冒出根以后,即可打开日光灯让其见光。经过两周左右,待苗木的根长到2——3厘米,叶片充分展开时,即可送至玻璃炼苗棚进行炼苗,使其充分吸收和适应自然光线。经过十天左右的炼苗,生根苗的根系发达,叶片和茎段的颜色由浅绿变成深绿,而且长得非常茂盛时,木质化程度较高时,即可进行生根苗的移栽。

针对以上原因,应对的办法是:首先应当确保接种室和培养室的卫生,每天接种前应打开紫外线消毒灯进行半小时消毒,室内地板应当保持干净整洁,超净工作台应用新洁尔灭擦拭过;其次确保用作接种材料的继代苗要干净无污染,接种时接种器具(如剪刀、镊子、盘子)都应进行高压灭菌,特别是培养基也应进行40分钟左右的消毒。操作的时候,剪刀、镊子还应当用消毒器再次进行消毒,时间为3——5分钟每次。只有每个环节都做好,才可以减少污染,降低苗木成本,提高苗木质量。

(2)生根率不高生根苗生根率不高,是由于生根激素不足或者不适合;其次是由于接种时选取的芽不好,木质化程度不够或太弱或玻璃化。所以,遇到生根率不高时,应当及时调整培养基配方,在接种时也要选取壮苗、优质苗进行接种。

当生根瓶苗炼苗至苗木充分木质化、叶片舒展、叶色浓绿、茎轴、根系伸长时即可移栽至育苗袋内种植。移栽前用0.15%~0.3%的高锰酸钾溶液进行基质消毒。移栽时,倒出培养基,小心洗去残留在根上的培养基,并截去过长的根,保留2cm左右,用0.1%的杀菌剂进行小苗消毒处理,根部再经IBA生根激素溶液处理后移入育苗基质中,然后置于育苗架上,在70%遮光度的荫棚内培育25~30天。移植初期要覆盖塑料薄膜保温保湿,等小苗高3cm生长稳定后即可进行露天炼苗,当小苗长至15~20cm时可以出圃造林。

接种室是进行组培研究或者组培生产工作最关键的地方,应当保持干爽安静、明亮清洁,保持良好的无菌或者低菌状态,应当与外界保持相对隔绝,尽量减少与外界空气对流,减少粉尘和微生物的侵入。所以,接种室外应有缓冲间,并配上密闭的拉门,减少与空气对流。每天接种前应先进行接种室的消毒工作,即开紫外线消毒灯照射半个小时,超净工作台也应当使用紫外线分钟,关闭紫外线灯后使气体散出后即可开始操作。另外,每十天或者半个月应当使用40﹪的甲醛加少量高锰酸钾进行密封熏蒸消毒。接种操作前,应用75﹪的酒精或者2.5﹪的新洁尔灭擦拭工作台、手臂以及进行接种的材料。注意接种室的卫生,不得在接种室内吃东西,平时每天下班要安排人员清扫接种室,以及及时清理掉不用和污染的接种材料。以减少污染源。接种操作间应当穿上干净的工作服、戴口罩、工作帽,出入时应当换拖鞋,以保持接种室的干净整洁。

培养室的要求与接种室基本一样,也需要干净、整洁、干燥,室温要保持在25℃——28℃。室内要定期消毒,用40﹪的甲醛加少量高锰酸钾进行密封熏蒸消毒。另外,培养室在设计时应当考虑光照问题,墙面以白色为主,窗口尽可能多一些,以利于采光,这样有利于炼苗。